联川线上单细胞培训课程答疑合集 | 单细胞专题
2月24、25日，我们进行了两场单细胞线上培训课程，错过的老师点击下方链接即可回看。
空间转录组 单细胞测序是什么关系，有什么相同和不同点
A：空间转录组是单细胞转录组的一种形式，可以分析空间分布上单个细胞的基因表达模式。
空间转录组技术原理：
将冰冻组织切片放置在10X Genomics Visium芯片的的捕获区域内，进行HE染色和成像后，对组织切片进行透化处理，细胞内的mRNA释放，从而被芯片上带有oligo-dT的探针捕获，并且每个探针都带有特异的空间Barcode，然后以mRNA为模版进行cDNA合成，构建文库后再通过测序，获得基因表达信息的同时，每一条测序reads因带有空间Barcode，从而能够获得基因表达的位置信息。
空间转录组相比常规单细胞转录组优势
下图A和B是两个肿瘤组织的切片，A样本中存在淋巴细胞浸润现象，预后效果良好；而B样本淋巴细胞都被肿瘤组织阻碍在肿瘤的边缘，预后效果差。通过单细胞转录组测序研究人员可以在临床肿瘤样本中发淋巴细胞cluster，但可能无法解释两个样本预后之间的差异。但是通过空间转录组，就能很清晰看到两个样本之间的差异。
如何判断测的质量好不好
10X单细胞测序在测序之前会经历几步质控，包括：
1、 细胞悬液质控：细胞活性越高越好，建议活性>85%以上、细胞总数足够、细胞碎拼合结团率均低于5%；
2、 cDNA质控：评估cDNA质检峰型是否和标准峰型相符，少杂峰和小片段峰；
除了以上测序前的质控，下一步评估数据好坏的标准就需要分析后才能获得，cellRanger针对每一个样本都会提供一份分析summary结果（网页版），提供的信息包含捕获得到的细胞数、fractions reads in cell、细胞监测基因/转录本中位数、总检测基因/转录本数、测序饱和度等信息，这些信息可以判断数据质量。
目前单细胞的几个主流平台的区别和优缺点
活细胞在前期细胞悬液的过程中，基因表达是否会出现变化
A：采用酶解法制备细胞悬液时，对于细胞是一种刺激，因此细胞基因表会发生变化，这是大概率会出现的情况。
前期制备悬液这一步骤我们怎么自己确定它符合要求呢
A：细胞悬液需要符合一定标准才能进行下游实验：
• 细胞总量：最开始获得的细胞起始量约 1x105个以上，上机之前的细胞悬液总量是目标捕获细胞数的3倍以上；
• 细胞活性：活细胞数在 90% 以上。细胞上样前通过染色和显微镜观察细胞活细胞数量， 可选择使用特定方法去除死细胞（磁珠法，细胞活力可提升25-40%）
• 最适上机浓度：700-1200 cells/µL
• 细胞大小：小于40 μm，几乎涵盖各种动物细胞类型（大于40um的细胞需要抽核）
• 细胞培养基及缓冲液不能含有 Ca2+和 Mg2+等影响酶活性的物质
• 组织一般需要新鲜标本， 不可冷冻， 植物细胞需制成原生质体
采集样品的时候是不是要求具有基本的实验操作设备
A：采集样本时需要的实验操作设备和试剂包括：无菌操作台（灭菌至少30min）、手术剪、手术镊子、手套、培养皿（35/60mm直径）、不含钙镁离子的1XPBS。
如果在获取样本后直接解离，还需要准备的实验操作设备和试剂包括：恒温振荡水浴锅（能调节至 37℃，70~150rpm）、细胞计数仪（或倒置显微镜+细胞计数板）、台盼蓝、涡旋震荡仪(其林贝尔-2 型号或其林贝尔-5 型)、计时器、移液枪（20μl、200μl、1ml）及枪头（部分为宽口）、细胞筛（30μm、40μm、70μm）、制冰机、冰盒、离心管架（15/50ml）、离心管架（1.5ml）、PCR管架（0.2ml）、离心管（0.2ml、0.6ml、2ml、5ml、15ml、50ml）
建议测序数据量是多少
A：单细胞3’转录组（V3）官方推荐最低测序数据量是20,000 read pairs/cell，测序模式为PE150，所以单个细胞最低测序数据量：150*2*20K=6000K=6M，5000个细胞的最低测序数据量即为5000*6M=30G
能不能做Treg细胞的单细胞测序
A：可以做特定筛选细胞的单细胞测序，需要先将目标细胞分选出来，保证细胞总数和细胞质量的前提下，即可开展目标细胞的单细胞测序。
最低的细胞量需要多少
A：最低细胞起始量有两个含义，组织解离后，最开始获得的细胞起始量建议 1x105个以上，经过裂红、去死细胞、清洗后得到的上机之前的细胞悬液总量，建议是是目标捕获细胞数的3倍以上
可以对不同组别某种细胞做WGCNA分析吗
A：单细胞测序可以做WGCNA分析
PBMC的单细胞测序验证如何进行，可以推荐一下相关文献吗
A：PBMC样本单细胞测序验证方式和实体组织验证方式一样，包括RNA-FISH、共聚焦免疫荧光、分选目标细胞后Bulk测序。关于相关文献，可以直接在Pubmed里面输入例如“PBMC scRNA-seq”关键词进行文章搜索
可以推荐一下免疫相关的单细胞测序文献吗
A：我们下载了几百篇10X单细胞测序文章并按照研究方向进行了分类，例如免疫、肿瘤、神经科学、细胞图谱等，有需要的老师可以联系当地销售经理进行索取。
酶消化而得的细胞悬液和细胞筛研磨得到的细胞悬液对测序有影响吗
A：不管是酶消化还是细胞筛研磨，都会对细胞产生影响。前者会刺激细胞产生应激导致基因表达发生改变，后者会产生机械损伤导致细胞悬液活性偏低。对于单细胞测序而言，对细胞活性要求很高，因此目前酶消化获得细胞悬液是主要的方法。
对于单细胞测序，如何解决通讯问题
A：细胞通讯主要是依靠生物信息学的方式进行分析，例如scanpy，可以构建不同细胞Cluster间的相互作用，可以理解为细胞通讯，更可靠的分析方法是依照细胞受体、配体基因表达模式构建细胞通讯。
图谱文章一般多少例数呢？
A：单细胞测序技术作为近两年新兴的技术，对样本的要求比较高，有时很难获得用于单细胞测序的样本，同时此项技术成本高昂，在早期部分研究会选择不做生物学重复，这在2018年发表的一些单细胞文章中可以体现。但是随着此项技术的普及和研究的深入，同时更重要的是，单细胞要解决的首要问题是异质性问题，不做生物学重复往往只能拿到片面的细胞图谱信息，因此单细胞测序生物学重复的要求要来越高，这一点从近期发表的文章也能看出，平均样本数至少3个以上。
表1：研究方向与与样本数、单样本细胞捕获数的关系
如果做单细胞测序需要我们自己查文章找marker基因判断细胞类型吗？
A：单细胞测序分析获得细胞聚类结果以后，接下来最重要的工作就是对不同细胞cluster进行定义，选择marker基因时最合适的方法是参考相同物种、相同样本类型的其他文章，从文献中提取marker基因，或者参考一些数据库，例如CellMarker、Mouse Cell Atlas等获得相应细胞的marker基因，然后公司再依照老师提供的marker基因做细胞定义。
做图谱的验证如果是选公认的基因，那还有验证的意义吗？只是为了说明测序的准确性？
A：无论是选择RNA-FISH还是免疫组化，或者免疫荧光标记，都是为了证明生物信息分析出来的细胞类型是真实存在的（生信分析出的细胞类型，也是参考细胞cluster的基因表达进行定义的，主要参考的就是一些公认细胞marker），这是验证的主要目的。此外，验证还能比较不同时间点、不同处理间目标细胞的相对含量变化，同样也是对分析结果的验证
如果用小鼠或者大鼠模型的样本做单细胞测序可以吗？
A：小鼠或者大鼠模型是可以做单细胞测序的，此类文章是很多的。
如何结合临床相关性分析？一般单细胞测序也就7.8个病人的，能结合预后吗？会不会样本数太少，没有说服力？
A：单细胞提供的细胞聚类结果，部分细胞类型的占比可能和预后相关，此时需要提取这些细胞的marker基因，做基因表达和预后的相关性，一般都会结合数据库开展此项分析，而不单单是单细胞采用的7、8例样本。
（类似）临床样本数量要达到多少比较可靠，因为人个体差异比较大？
A：临床样本最好的建议是越多越好，当然考虑到成本投入，建议每组最少能在5例及以上。
细胞测序发现多个未知亚群后，应该如何从测序的数据中寻找亚群的marker？
A：10X单细胞测序在分析获得细胞聚类以后，会提供每一个细胞Cluster相比较于其他clusters的上调基因信息（可以理解为marker基因），此时可以利用这些信息寻找亚群marker
RNA-FISH验证，你的样本先进行切片进行杂交，剩下的部分做测序吗？
A：单细胞测序和RNA-FISH是非同步进行的，需要在拿到单细胞测序结果之后，才能选择哪些RNA做FISH验证。因此可以在做完单细胞测序之后，再选择相同类型测样本做验证，也可以在准备单细胞测序样本的时候，将样本分成两份，一份做测序，一份保存固定好，后续用于验证。
单细胞没有对照组可以分析吗？或同一种疾病，有不同的类型，如果做比较选择什么样细胞亚群去分析较好？
A：如果课题设计是分析不同疾病亚型的细胞构成和差异，单细胞测序是可以不选择做对照组的，已经有不少类似的文章。
同一种疾病，有不同的类型做比较的时候，需要选择样本间细胞构成差异较大的细胞进行分析，或者选择和疾病分型、疾病发展高相关的细胞群体。
做完了单细胞测序后，后面验证最少需要多少样本量？
A：单细胞测序验证选择4-6例就可以
能通过利用网上的数据库鉴定吗，还是说目前都需要自己提供marker来判断？或者说做单细胞测序是拿到结果后我们自己查文章找marker基因判断细胞类型吗还是之前就要查文章找marker基因
A：可以利用网上数据库信息辅助鉴定细胞类型，同时还是建议能从文章中提取marker信息，毕竟数据库信息整合的信息比较多，也比较杂，不如参考文献的方式准确。对于单细胞测序结果拿到之前还是之后查文章找marker，这个是没有限制的，因为在开展单细胞项目之前，所做样本类型是已知的，样本中可能的细胞类型或者主要细胞类型还是能大致了解的，因此可以在拿到单细胞测序结果之前就可以做这项工作的。
这种图谱类测序文章有什么可投的期刊推荐吗？
A：图谱类测序文章可投的期刊信息可以参考我们公司编写的《单细胞测序一本通》一书，里面有详细信息。
单细胞测序发现多个未知亚群后，应该如何从测序的数据中寻找亚群的marker？
A：10X单细胞测序在分析获得细胞聚类以后，会提供每一个细胞Cluster相比较于其他clusters的上调基因信息（可以理解为marker基因），此时可以利用这些信息寻找亚群marker
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